聚乙二醇交联多臂聚（L-赖氨酸）详细介绍

介绍
在过去的几十年中，纳米技术已经很好地发展到构建药物递送系统，包括但不限于胶束、脂质体和纳米颗粒[1-10]。与传统制剂相比，这些纳米级给药系统（DDS）在提高药物稳定性、防止药物过早释放、改变药物分布和延长药物半衰期方面表现出巨大潜力[11]。因此，它们被广泛用于各种药物的输送，包括抗癌药物[1，2]，抗菌剂[3，4]和抗炎药[5，6]等。

纳米级DDS虽然在单药治疗药物方面表现出优势，但在提高多病因疾病综合疗效方面仍存在诸多局限性。事实上，许多常见的临床疾病是由多种因素相互作用引起的或恶化的。例如，烧伤创面感染常因细菌感染而加重，例如铜绿假单胞菌（铜绿假单胞菌）和金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）[12]。当肝实质和代谢功能的大量丧失诱发急性肝衰竭时，患者将变得易感病原体，这在很大程度上限制了晚期紧急肝移植的可行性[13]。另据报道，细菌感染可能是诱导肿瘤形成的主要原因之一， 因此，应同时采用抗癌和抗菌措施治疗这些疾病，例如幽门螺杆菌诱发的胃癌[14]。因此，为了治疗多因素疾病，应合理开发DDS，以共同递送治疗剂和抗菌剂，如抗生素[3]、抗菌肽[15，16]、金属离子[4]和天然化合物[17]。

为此，最常见的策略之一是在一个制剂中共同递送两种或两种以上的药物[18，19]。然而，由于纳米载体的载药空间有限，共递送策略通常无法同时实现多种药物的充分载样[18-20]。最近，聚（异赖氨酸）（PLL）基聚合物已被制造用于封装带负电荷的药物，例如小分子药物[21-23]，蛋白质[24，25]和核酸[26，27]。值得注意的是，Qiao等人[15]发现基于PLL的聚合物具有类似于普通抗菌肽（AMP）的杀菌机制，具有去除细菌感染的巨大潜力。我们之前的研究[16]还表明，多臂PLL（MPLL）具有高抗菌活性、巨大的选择性和显着的蛋白水解稳定性， 代表了一系列治疗耐药感染的强效抗菌肽[16]。所有这些研究进展都预测，基于PLL的聚合物不仅可以作为药物载体，还可以作为具有治疗活性的大分子来协同治疗效果，这意味着纳米医学针对多因素疾病的设计有了新的视角。

在这项研究中，设计、合成和评估了MPLL-alt-PEG（方案1）形式的聚乙二醇（PEG）交联交替共聚物，作为阴离子药物递送和抗菌的平台。具有支化聚乙烯亚胺（PEI）核心和聚（i-赖氨酸）外围链的MPLL构成了MPLL-alt-PEG共聚物的聚电解质段。它们的多臂分子结构具有较高的阳离子电荷密度，有利于通过静电相互作用增强对阴离子药物和细菌脂质双层的结合亲和力[16]。预计MPLL-alt-PEG可以包封阴离子药物，然后自组装成壳交联聚离子复合物（PIC）胶束（方案1）。 我们之前的研究表明，壳交联胶束可能具有优势，无效载药，提高胶束稳定性，并保护药物免于过早释放和降解[28]。同时，交联后MPLL的抗菌活性也可以提高，因为交联反应会导致分子量、蛋白水解稳定性和体内半衰期增加[16，29]。载药MPLL-alt-PEG胶束可以整合负载药物的治疗效果和载体的抗菌活性。我们证明了MPLL-alt-PEG作为小分子药物和治疗性生物大分子的DDS的可行性，使用水溶性甲基橙（MO）和免疫激素重组人干扰素-a-2b（IFN）作为阴离子模型药物。随后 以革兰阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和革兰阴性铜绿假单胞菌为模型菌，研究了MPLL-alt-PEG的抗菌活性和机制。我们预计基于MPLL-alt-PEG的纳米平台可以作为治疗细菌感染涉及多因素疾病的潜在系统。

2.材料与方法
2.1.材料
支化PEI（Mw = 0.8 kDa）是从Sigma-Aldrich（中国上海）获得的。g-苄氧羰基-L-赖氨酸（ZLL）购自GL Biochem（中国上海），无需进一步纯化即可使用。PEG（琥珀酰亚胺羧甲酯）2（SCM-PEG-SCM，Mw = 7.5 kDa）由JenKem科技有限公司（中国北京）提供。甲基橙、苯甲醚、甲磺酸、和异硫氰酸荧光素（FITC）均来自阿拉丁（中国上海）。Viskase（美国伊利诺伊州达连）生产了分子量截止值（MWCO）为7和14 kDa的透析管，而50 kDa和100 kDa的透析管则从Spectrum Laboratories Inc.（美国加利福尼亚州洛杉矶）购买。IFN（500万U）是从安徽安科生物科技有限公司（中国安徽）获得的。
2.2.MPLL-alt-PEG共聚物的合成与表征
在PEI引发的e-苄氧羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐（ZLL-NCA）聚合的连续过程中合成MPLL-alt-PEG共聚物，以制备PEI接枝聚（e-苄氧羰基-L-赖氨酸）（PEZ），然后与双官能团SCM-PEG-SCM进行外围交联，随后去除苄氧羰基侧链保护基团（图1）。
第一步，根据我们之前的报告，ZLL在无水乙酸乙酯中光气化（收率：78%）制备ZLL-NCA，然后以PEI为大分子引发剂聚合d，得到星嵌段共聚物PEZ（产率：92%）[16，24，28，30]。

然后，将100mgPEZ溶解在50mLDMSO和250mL二氯甲烷（DCM）的混合物中。将DCM中浓度为0.2g-mL-1的SCM-PEG-SCM溶液滴加到PEZ溶液中，在25°C剧烈搅拌条件下滴加24小时，产生PEZ-alt-PEG[28]。通过旋转蒸发浓缩溶液以除去DCM，并透析（MWCO 14 kDa）对水。随后，通过冻干得到PEZ-alt-PEG共聚物。产率：95%。

最后，将PEZ-alt-PEG溶于TFA中，然后加入苯甲醚和甲磺酸，室温搅拌1.5h后，用蒸馏水稀释溶液，洗涤3次。收集水层，然后用碳酸氢钠中和。之后，将样品转移到透析管（MWCO 7 kDa）中，并在5.0wt%NaHCOg水溶液下透析两天，随后在蒸馏水中透析五天。然后将透析产物冻干以获得最终产物MPLL-alf-PEG。产量： 91 %
以DMSO-M为溶剂，在布鲁克DMX 400 MHz波谱仪（德国卡尔斯鲁厄布鲁克）上端接P EZ和PEZ-alt-PEG的核磁共振（NMR）波谱，而MPLL-alt-PEG以D2 O为溶剂。各种cop聚合物的分子量通过配备沃特世51 5 HPLC泵和沃特世2414折光率检测器的凝胶渗透色谱（GPC）系统（美国米尔福德沃特斯）测定。为了表征PEZ和PEZ-alt-PEG，使用线性聚甲基丙烯酸甲酯（PMMAs）作为标准品，以二甲基甲酰胺（DMF）为洗脱液分析样品。为了表征MPLL-alt-PEG，对样品进行测量，并使用0.50 M H Ac-N和Ac缓冲液（pH 4.5）作为淋洗液，线性PEG作为st标准品。

2.3.载药MPLL-alt-PEG胶束的制备与表征
为了评估MPLL-alt-PEG对小阴离子分子的封装，将给定量的MO加入到水中的MPLL-alt-PEG溶液中（10mL）中并搅拌5分钟。然后将获得的溶液在下沉条件下对水透析（MWCO 50 kDa）以除去游离客体分子。在相同条件下，选择具有等量游离MO的溶液作为透析对照。当对照组MO溶液透析至无色时，得到MO/MPLL-alt-PEG胶束，用紫外-可见分光光度计测定透析液中MO的含量。采用标准校准曲线定量0.1-6 mg-L-1浓度范围内线性相关系数（r2）>0.99的MO，载药量以MO对聚合物的质量百分比计算。

为了评估MPLL-alt-PEG对阴离子生物大分子的包封，按照报道的方法用FITC标记IFN[31]。随后，将MPLL-alt-PEG和FITC标记的IFN（FITC-IFN）溶液分别溶解在浓度为2mg-mL-1的0.01M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中。然后将1 mL IFN溶液滴加到5 mL聚合物溶液中，在超声仪上超声处理5 min（KQ-200 KDE，昆山超声仪器有限公司
中国昆山，40 kHz，100 W），然后在下沉条件下用0.01 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）透析（MWCO 100 kDa）。游离FITC-IFN在0.01M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中也作为对照进行透析。当对照实验中的游离IFN去除后，使用FITC-IFN的标准校准曲线，使用FITC-IFN的标准校准曲线，通过Spectramax Gemini XS微孔板荧光计（分子器件合作，美国加利福尼亚州桑尼维尔）测量外透析液中FITC-IFN的量，然后从添加的FITC-IFN总量中减去该值以计算FITC-IFN的负载量。载药量计算为FITC-IFN对聚合物的质量百分比。

使用JEOL JEM-1400透射电子显微镜在100 kV的工作电压下观察成型胶束的形貌（JEOL，日本东京）。使用Zetasizer Nano ZS90（英国伍斯特郡马尔文仪器有限公司）在25°C下记录聚合物和胶束的粒径和zeta电位。测试前使用0.01 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将溶液稀释至1 mg-mL-1。

2.4.pH 敏感释放从胶束
将装有FITC-IFN的胶束溶液（5 mL）转移到透析袋（MWCO 100 kDa）中，然后将袋子放入150 mL的0.02 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、0.02 M HAc-NaAc缓冲液（pH 5.5）或0.02 M HAc-NaAc缓冲液（pH 4.5）中。聚合物/FITC-IFN配合溶液的制备如第2.3节所述。以预定的时间间隔，抽出给定体积的释放培养基并补充等体积的新鲜缓冲溶液。用微孔板荧光计测定IFN的释放量，计算药物的累积释放量，并绘制药物释放的百分比与时间的关系图。所有实验一式两份进行。

2.5.最小抑菌浓度（MIC）的测量
采用肉汤微量稀释法研究了聚合物对革兰氏阳性MRSA和革兰氏阴性铜绿假单胞菌的抗菌活性。将细菌细胞在37°C的Mueller Hinton肉汤（MHB）培养基中以300rpm不断振荡以达到中期对数生长阶段。将微生物悬浮液稀释并调节至2 X 105菌落形成单位（CFU）-mL-1。使用MHB对聚合物进行一系列两倍稀释，细菌浓度范围为60至0.2^M。将每种稀释的聚合物溶液共50个加入到96孔微孔板中，然后加入50 rL细菌悬浮液，得到1 X 105 CFU-mL-1的最终接种物。在37°C孵育18小时后，用酶标仪（Synergy HT， BioTek Instruments Inc.，Winooski，VT，美国）。未添加聚合物处理的细菌细胞和未添加细菌的聚合物溶液分别用作阳性和阴性对照。MIC被定义为18小时后抑制细菌生长的浓度。

2.6.溶血测定
新鲜小鼠血液用K2EDTA处理，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤3次，然后以1000g离心10分钟以分离红细胞。然后，获得红细胞并用PBS（pH 7.4）稀释至终浓度为5%（v / v）。将50 rL不同浓度的聚合物溶液与等体积的红细胞悬浮液在96孔微孔板上混合，然后孵育1hat37°C。 以1000X g 离心10分钟后，将上清液的等分试样（30RL）转移到另一个96孔微孔板中，并用100RL的PBS稀释。

通过使用Biotek Synergy TH酶标仪在540nm处测量吸光度来监测红细胞悬浮液中血红蛋白的释放。用2%Triton X-100裂解的红细胞的吸光度用作阳性对照，并采取100%溶血，而PBS溶液中未经处理的红细胞悬浮液用作阴性对照。同时，应用聚合物溶液对照样品排除聚合物吸收干扰（假阳性结果），并根据报告的方法检查是否存在假阴性结果[32]。每次测试重复三次。根据以下公式（1）计算溶血百分比：
溶血 （%）=[（久样品 — A 阴性）/0 阳性 — 久阴性）] X 100% （1） 其中 A 样品代表处理样品的吸光度，^阴性代表阴性对照的吸光度，A阳性代表阳性对照的吸光度。

本研究中的所有动物实验均根据《实验动物护理和使用指南》进行，并得到汕头大学医学院动物伦理委员会（SUMC2016-200，2016年12月5日）的批准。

2.7.微生物的成像研究
使用类似于MIC测定的方案在2X MIC下生长并与聚合物混合细菌细胞。在37°C孵育90分钟后，收集细菌细胞，用PBS（5000X g，10分钟）洗涤两次，并在4°C下用等体积的2.5%戊二醛溶液固定4小时。 将细菌细胞在0.1M PBS（5000X g，10分钟）中冲洗，并进一步固定在1%锇酸（4°C中2小时）。在0.1M PBS中冲洗后，通过分级系列乙醇（30-100%）使细胞脱水。

为了通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察，将脱水样品转移到乙醇和乙酸异戊酯的1：1混合物中30分钟，然后转移到绝对乙酸异戊酯中1 h。对样品进行临界点干燥，溅射涂覆一层薄薄的金，并用FE-SEM（SU8010;日立，东京，日本）。
为了通过透射电子显微镜（TEM）观察，将脱水样品转移到丙酮中20 min，转移到丙酮和Spurr树脂的1：1混合物中1 h，然后转移到树脂和无水丙酮的3：1混合物中3 h。最后，将样品转移到Spurr树脂中并孵育过夜。获得厚度为70-90nm的切片，并在TEM设置下进行TEM观察之前用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色10分钟（H-7650，日立，东京，日本）。

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