Nanogold®-链霉亲和素原位杂交

1.4 nm Nanogold® 金纳米粒子探针 体积小，不聚集，因此能够接触核抗原，这使得它们成为超灵敏原位杂交检测特定 DNA 序列（无论是否使用原位PCR）的优秀试剂。

内容

• Nanogold®-链霉亲和素原位杂交

• Nanogold®-Silver原位杂交与“CARD"系统

• 使用 Nanogold®-Silver原位杂交与“CARD"系统进行 RNA 检测

• 使用 Nanogold®-链霉亲和素-银进行免疫标记来检测针对单克隆一抗的生物素化二抗

优点

• 结合标签扩增单基因拷贝分辨率，比 NBT-BCIP 碱性磷酸酶或过氧化物酶更灵敏。

• 大多数情况下不需要更冗长的 PCR 程序。

• 避免由于错误引发和扩增子扩散而导致 PCR 出现假阳性。

• 使用标准明场显微镜可轻松看到黑色；不需要昂贵的荧光光学器件，也没有自发荧光和漂白信号丢失的问题。

• 黑色与全强度标准细胞和核染色剂（H＆E、核固红、甲基绿）兼容，极大地改善了形态学评估。

• 也可用于 EM 研究。

单独给出了 Nanogold®-链霉亲和素原位杂交的完整方案，无论是否有 CARD 系统。

Nanogold®-链霉亲 和素原位杂交

© 伊顿出版公司；经许可使用。

图 1：纳米金-银原位杂交技术的示意图。通过与生物素标记的 cDNA 探针杂交来检测宿主细胞中的 DNA 序列。然后使用链霉亲和素-Nanogold 检测与间隔臂共价结合的生物素，并随后使用乙酸银或乳酸银自动金相术进行银增强。为简单起见，仅显示了四种此类生物素和链霉亲和素-Nanogold 分子。 Hacker, GW、Hauser-Kronberger, C.、Zehbe, I.、Su, H.、Schiechl, A.、Dietze, O. 和 Tubbs, R.；细胞视觉， 4，54-65（1997）。

 

 

使用该方法检测人乳头瘤病毒6/11型基因组如下所示；可以看出，Nanogold®-银染色产生浓密的黑色信号，在许多情况下比使用传统酶底物获得的信号更清晰。

纳米金银 ISH 检测尖锐湿疣中的 HPV 6/11。在这种情况下，获得了强标记。大多数感染的细胞核呈致密黑色或颗粒状黑色染色。一些细胞核还显示出单个黑点标记，表明这种 DNA 病毒的拷贝数非常低。染色如方案中所述；福尔马林固定、7 微米厚的石蜡切片，用苏木精和伊红复染。放大倍数，X 285。

Nanogold®-Silver原位杂交与“CARD"系统

CARD - 催化报告沉积（也称为TSA® 或酪酰胺信号放大；可从NEN Life Sciences获得的试剂盒） - 是一种系统，其中链霉亲和素连接的过氧化物酶分子用于在感兴趣的位点催化积累生物素化的酪酰胺。这在使用 Nanogold®-链霉亲和素和银增强进行检测之前，在程序中插入了额外的扩增步骤；结果是灵敏度大幅提高，从而可以检测单拷贝基因，而不会遇到 PCR 相关的困难。

图2：CARD-纳米金-银 原位杂交技术的示意图。通过与 FITC 标记的核糖核酸探针杂交来检测宿主细胞中的 RNA 序列。然后针对 FITC 的第一抗体层与用作核酸报道分子的 FITC 分子结合。下一层是针对提供一抗的物种 IgG 的二抗，用生物素标记。为了简单起见，仅显示了这两种抗体中的每一种。然后生物素与链霉亲和素-生物素-过氧化物酶（S-ABC-过氧化物酶）复合物结合。显示了四个这样的分子，每个分子都携带过氧化物酶。然后，这些过氧化物酶分子催化生物素化酪酰胺的积累（催化报告沉积），最终导致生物素标记的“倍增"。作为最后一层，链霉亲和素-Nanogold随后使用醋酸银或乳酸银放大（自动金相学）。这些最终的链霉亲和素分子中的每一个都可以检测许多生物素分子中的一个。通过这种方式，可以实现巨大的扩增，在许多情况下无需 PCR 或 3SR 技术即可实现单基因拷贝敏感性。

Hacker, GW、Hauser-Kronberger, C.、Zehbe, I.、Su, H.、Schiechl, A.、Dietze, O. 和 Tubbs, R.；细胞视觉， 4，54-65（1997）。

© 伊顿出版公司；经许可使用。

该程序用于检测宫颈癌标本培养的 SiHa 细胞中的 HPV-16（一种 cDNA 病毒）。已知这些细胞仅含有一到几个病毒 DNA 拷贝； Nanogold®-链霉亲和素原位杂交与 CARD 结合产生细胞核的致密黑色颗粒染色；黑色信号比过氧化物酶-链霉亲和素产生的信号更容易区分。该程序可能会在 5 至 7 小时内完成；

通过 CARD 扩增的纳米金银ISH 检测到 SiHa 细胞中 HPV 16 的单拷贝。这种源自宫颈癌的细胞系仅含有一到几个 HPV 16 拷贝，通过所应用的技术显示为单个斑点（详细信息请参阅实验方案）。细胞离心涂片制备，用核固红复染。在福尔马林固定石蜡材料的组织切片中获得了类似的染色(Zehbe等人，Am.J.Pathol.150 , 1553-1561(1997))。原始放大倍数，X 560。

使用 Nanogold®-Silver原位杂交与“CARD"系统进行 RNA 检测

RNA的检测具有同样高的灵敏度，如下图：

霍奇金病中的 Epstein-Barr 病毒；使用RNA 检测方案进行高灵敏度检测的示例。原始放大倍数，X 400。

使用 Nanogold®-链霉亲和素-银进行免疫标记来检测针对单克隆一抗的生物素化二抗

Nanogold®-链霉亲和素在免疫标记实验中也能发挥良好作用。下面显示了一个例子，其中它用作针对针对单克隆一抗的生物素化多克隆二抗的三级探针，以探测乳腺癌抗原。

使用间接 Nanogold® 标记检测 Ki-67 乳腺癌抗原。使用一抗和生物素化山羊抗小鼠二抗检测 Ki-67 抗原；使用 Nanogold®-链霉抗生物素蛋白（250 倍稀释）和自动金相学对其进行可视化。原始放大倍数，X 400。