流式细胞术应用荧光染料简介

荧光是指光致发光现象。当某种室温物质受到一定波长的入射光照射时，分子中的电子吸收光能后达到高能级，进入激发态，并立即去激发并恢复到原来的状态，而多余的能量则以光的形式辐射出去，即发出比入射光波长更长的光（通常在可见光波段）。一旦停止入射光，发光现象立即消失。也就是说，当物体吸收短波光的能量时，它可以发射比原来吸收的波长更长的光。具有这种性质的物质或分子称为荧光素或荧光染料。

当激光束与细胞正交时，通常会产生两个荧光信号。一是细胞本身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；定量分析可以深入了解所研究的细胞参数的存在和定量。

(1) 荧光信号的意义

荧光信号可以反映不同细胞的生物学特性。例如，荧光染料标记的单克隆抗体与细胞表面的抗原、受体或膜糖蛋白特异性结合，在激光的激发下发出一定波长的荧光。荧光信号的强度反映了膜抗原、受体或糖蛋白的相对数量。通过收集和分析荧光信号，可以实现细胞亚群和功能的分析。 DNA用DNA染料染色，染料以一定的方式与DNA链结合。在激光的激发下，染料发出荧光，通过测量荧光的强度，可以获得相对DNA含量，进而确定细胞周期阶段。分析。使用特定的荧光染料还可用于测量细胞钙离子浓度、细胞内pH值和细胞膜电位。

(2)荧光染料的选择

可以使用的荧光染料有很多种，由于它们的分子结构不同，它们的荧光激发和发射光谱也不同。选择染料或单克隆抗体标记的荧光素时，必须考虑仪器配置的激光光源的波长，即染料的激发光谱；仪器激光器的激发光波长尽可能接近荧光染料的激发光谱峰；另外，荧光染料还必须考虑染料的发射颜色，即染料的发射光谱，需要选择合适波段的检测器来检测相应的荧光信号。

由于目前的流式细胞仪配备有多个荧光信号检测器，当仪器同时检测多个荧光时，每个荧光检测器只允许一定波长的荧光信号进入并被检测，因此用户必须选择合适的荧光信号接收器才能接收好的信号。还需要注意的是，使用激光波长相同的荧光染料，其发射波长不同，这样才能被相应波段的检测器接收到，达到同时检测的目的。

检测器的选择基于了解荧光染料的发射光谱。以三色FCM为例，如果荧光光谱峰落在绿色范围内（波长515-545nm），则选择第一个荧光检测器；如果光谱值落在橙红色范围内(564-606nm)，则选择第二荧光检测器；如果荧光光谱值落在深红色范围内（波长650 nm），则选择第三个荧光检测器。目前桌面FCM常用的激光为488nm，常用的染料有PI、PE、FITC、PERCP、CY5、APDye Fluors等。

(3) 荧光标记抗体组合

在使用流式细胞术进行多色分析时，如果想要得到理想的分析结果，需要选择抗体的荧光匹配。经常考虑的因素如下。

1 荧光素的荧光强度

特定抗体区分阴性和阳性结果的能力取决于该抗体标记的荧光素。每种荧光素具有不同的光子释放能力和不同的相对荧光强度。一般用染色指数来比较不同荧光标记的光信号强度。染色指数是阳性信号与阴性信号之差与阴性峰分布宽度的比值，用于判断荧光染料区分弱阳性表达的能力。同一个单克隆抗体用8种不同的荧光素标记，得到不同的染色结果。我们需要找到一种具有更高染色指数的荧光染料来标记微弱的信号。

可以看出，对于特定的单克隆抗体，由于使用不同的荧光素标记，阴性核阳性细胞的S/N比（信噪比）可相差4-6倍。一般来说，荧光信号由强到弱的顺序为：PE>APC>PE-CY5>PERCP-CY5.5>FITC>PERCP。

选择荧光标记抗体时，需要考虑以下因素：

荧光素标记效率：抗体上标记的荧光素量（F/P）值也会影响相对荧光强度。每个抗体可以标记多个 FITC 或 PERCP 分子（通常为 2-9 个），而 APC 和 PE 标记的量约为每个抗体一个荧光分子。 FITC是小分子化合物，而PE、PERCP和APC是分子量较大的荧光蛋白。受荧光标记化学性质的限制，IGM型抗体通常仅标记小分子荧光素，如FITC、TEXAS RED、CY3和CY5等。

抗体检测的抗原密度：高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体来检测，而低表达的抗体则需要用信噪比较高的荧光素标记的抗体来检测，从而有效区分阳性细胞群和阴性细胞目的。

细胞自发荧光：每个细胞群的自发荧光水平各不相同，尽管可以观察到高荧光强度的细胞，但在高波长范围（>600nm）中自发荧光迅速下降。当检测具有高水平自发荧光的细胞时，使用具有较长发射波长的荧光染料（例如 APC）可以获得更好的信噪比。如果是自发荧光水平较低的细胞，那么使用较长波长的激发光对于改善正负差异的现象影响不大。可以使用 FITC 标记的抗体。

2 非特异性结合

一些荧光标记抗体表现出低水平的非特异性结合，导致阴性细胞中的荧光水平增加。这种非特异性结合通常由两个因素引起：

单克隆抗体的同型对照：一些 IGG 型同型对照对某些细胞类型的 FC 受体结合更敏感

使用荧光素：有时 CY3、CY5、CY5.5 和德克萨斯红直接标记的抗体以及一些串联偶联抗体可增强与某些细胞亚群的结合。对于CY5，研究表明，这主要是由于染料与低亲和力FC受体的相互作用较弱； PE-CY5标记的抗体也有类似的效果。另外，在某些情况下（例如用抗HLA-DG PE/抗单核细胞PerCP-CY5.5分析单核细胞），该功能也可用于有意增加标记抗体中CY染料的标记量，这确保了无论每个单核细胞的 CD14 表达水平有何差异，都可以检测到单核细胞。

总之，在通过流式细胞术进行多色分析时，应仔细选择荧光抗体标记的荧光染料。主要影响因素有：根据不同型号选择合适的荧光抗体（激光功率和波长）；染色细胞抗原表达的相对密度（表达密度低的抗原应选择较亮的荧光染料）； FC 对阴性细胞受体状态。另外，在进行多色分析时，需要尽可能选择荧光波之间光谱重叠较少的荧光染料进行组合，同时需要进行正确的调整和补偿。

3. 荧光补偿的调整

当细胞携带两种或多种荧光素（如PE和FITC）并被激光激发发射两种以上不同波长的荧光时，理论上可以选择滤光片使得每种荧光只能被相应的检测器检测到，而将不会检测到其他荧光。然而，由于目前使用的各种荧光染料具有较宽的发射光谱特性，虽然各自的发射峰不同，但发射光谱范围有一定程度的重叠，因此少量不需要检测的另一种荧光信号也会被检测到。被检测到。是通过这个光电倍增管来检测的，所以每个光电倍增管实际上检测的是两种荧光的总和，只不过每种荧光都以某一种荧光为主。荧光素的发射光谱有一定的范围，其发射信号的极小部分必然会进入另一次检测。 FITC 检测器将检测少量的 PE 光谱，而 PE 光谱检测器将检测更多的 FITC 光谱。

由于光谱重叠占检测信号的一定比例，因此荧光补偿的方法是从接收到的荧光信号中减去另一检测器中接收到的信号（即光谱重叠）的一部分，从而使另一检测器信号 该检测器检测到的信号与负背景信号一致，因此光电倍增管中输出的信号实际上仅代表一定检测的信号，而不受其他波长的荧光信号的干扰。利用标准的已知单阳性样本，可以合理设定荧光信号的补偿值。补偿程度可以通过同时测量双荧光参数的仪器条件来确定。补偿时，首先测量染料的荧光 (FL1)。此时，除了应接收荧光的光电倍增管如FL1检测器有信号输出外，其他光电倍增管FL2检测器也常常出现微弱的输出。调整补偿 然后调整补偿器FL2-%1FL1，使FL2检测器输出的平均荧光强度与负信号一致；然后测量另一种染料（FL2），然后调节补偿器FL1-%FL2，使FL1检测器输出的平均荧光强度与负信号匹配。负面信号是一致的。如此反复调整，FL1和FL2探测器即可得到充分补偿。除了应接收荧光的光电倍增管如FL1检测器的信号输出外，其他光电倍增管FL2检测器也常常输出微弱。调整补偿 然后调整补偿器FL2-%1FL1，使FL2检测器输出的平均荧光强度与负信号一致；然后测量另一种染料（FL2），然后调节补偿器FL1-%FL2，使FL1检测器输出的平均荧光强度与负信号匹配。负面信号是一致的。如此反复调整，FL1和FL2探测器即可得到充分补偿。除了应接收荧光的光电倍增管如FL1检测器的信号输出外，其他光电倍增管FL2检测器也常常输出微弱。调整补偿 然后调整补偿器FL2-%1FL1，使FL2检测器输出的平均荧光强度与负信号一致；然后测量另一种染料（FL2），然后调节补偿器FL1-%FL2，使FL1检测器输出的平均荧光强度与负信号匹配。负面信号是一致的。如此反复调整，FL1和FL2探测器即可得到充分补偿。调整补偿 然后调整补偿器FL2-%1FL1，使FL2检测器输出的平均荧光强度与负信号一致；然后测量另一种染料（FL2），然后调节补偿器FL1-%FL2，使FL1检测器输出的平均荧光强度与负信号匹配。负面信号是一致的。如此反复调整，FL1和FL2探测器即可得到充分补偿。调整补偿 然后调整补偿器FL2-%1FL1，使FL2检测器输出的平均荧光强度与负信号一致；然后测量另一种染料（FL2），然后调节补偿器FL1-%FL2，使FL1检测器输出的平均荧光强度与负信号匹配。负面信号是一致的。如此反复调整，FL1和FL2探测器即可得到充分补偿。

进行多色分析时，必须使用每个荧光素单阳性样品进行检测，并调整与其他荧光通道的补偿，以保证多色分析结果的准确性。由于多色分析荧光补偿的复杂性，许多分析软件都允许离线补偿，这为操作者提供了极大的便利。

值得注意的是，补偿与特定实验的特定荧光素组合、特定仪器条件设置有关。补偿设置后，如果光电倍增管的电压、激光器的波长、滤光系统等发生变化，荧光补偿值就会发生变化，需要重新调整补偿。