免疫测定的方法有哪些？

利用抗原和抗体的特异性结合特性，通过免疫分析技术可以对细胞因子进行定量或定性检测。尽管细胞因子的种类很多，但只要获得针对细胞因子的特异性抗体（包括多克隆或单克隆抗体），就可以采用免疫分析法进行检测。常用的方法包括ELISA、RIA、Western blotting、免疫荧光以及基于免疫荧光技术的流式细胞术分析。

1. 酶联免疫吸附法

ELISA是应用广泛的异质酶标记免疫分析技术。一步或多步抗原抗体反应和一步酶促反应构成了ELISA的基本步骤，可用于定性或定量分析。双抗体夹心法是细胞因子测定常用的方法。该方法中使用的抗体可以是针对同一抗原的多克隆抗体或针对同一抗原的不同表位的单克隆抗体。

细胞因子测定的标本主要包括两类，一类是血清（血浆）、滑液、胸水、脑脊液或腹膜液等体液，可用于细胞因子和可溶性粘附分子的检测；另一种是体外培养后的细胞培养。上清液仅用于细胞因子的检测。

ELISA方法具有特异性强、简便、易于推广和标准化等优点。此外，该方法还可以检测无生物活性的细胞因子前体、分解片段以及与相应受体的缀合物。缺点是灵敏度较低，无法判断细胞因子的生物活性。

2. 流式细胞仪

流式细胞术是一种基于荧光抗体染色技术和流式细胞术灵敏分辨率的方法。该方法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测。通过特异性荧光抗体染色，可以简单快速地进行单细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，并且可以准确确定不同细胞亚群的检测。细胞因子和膜分子的表达。根据荧光抗体的性质，荧光抗体染色可分为直接法和间接法。前者使用荧光标记的细胞因子或粘附分子的特异性抗体，而后者则使用荧光标记的二抗。直接法较为常用，虽然其灵敏度不如间接法，但特异性强。

该方法检测细胞内细胞因子时，主要包括以下基本步骤：

1. 待测细胞的分离和培养

2. 细胞固定常用的细胞固定液为4%多聚甲醛。

3. 封闭非特异性结合位点 用含有 5% 脱脂奶粉和钙、镁离子的 PBS 溶液重悬固定的细胞。

4.染色与分析采用荧光素标记的细胞因子特异性单克隆抗体进行荧光抗体染色，流式细胞仪分析荧光阳性细胞百分率和荧光强度。另外，如果使用两种或多种细胞因子的不同荧光素标记的单克隆抗体，则可以同时检测同一细胞中两种或多种不同的细胞因子。

该方法还可用于区分具有不同分泌特性的细胞亚群，例如 Th1 和 Th2 细胞。

3.酶联免疫斑点法

酶联免疫斑点试验（ELISPOT），源自ELISA，但突破了传统ELISA，是抗体形成细胞定量测定的延伸和发展，已越来越多地应用于类风湿因子、IFN-γ等细胞因子的定量测定的分泌细胞。

ELISPOT优于传统的抗体、细胞因子或其他可溶性分子分泌细胞检测方法，可以检测20万至30万个细胞中1个分泌相应分子的细胞。如果引入生物素和亲和素系统，则很敏感。做ELISPOT时，所选的特异性抗体应具有高亲和力、高特异性、低内毒素的特点。所选的细胞激活剂不得影响细胞的分泌功能。

4. 免疫测定的方法学评价
免疫测定可用于检测几乎所有细胞因子。与生物活性测定相比，主要优点和缺点是：

优点：①特异性高，使用特异性单克隆抗体可用于单一细胞因子的检测； ②操作简单、快速，不需要依赖细胞系，因此不需要维持培养，大大增加了方法的可操作性，易于普及，便于普查； ③影响因素相对较少且易于控制，重复性好，方法易于标准化。

缺点：①测量的只是细胞因子的蛋白质含量，与其生物活性不一定成正比； ②测定结果与所用抗体的来源和亲和力有很大关系。当使用具有不同亲和力的mAb时，检测到相同的样品。结果可能会有所不同； ③灵敏度较低，比生物活性法低10～100倍左右，测定下限一般为100pg； ④ 如果样品中存在可溶性细胞因子受体，可能会影响细胞因子特异性抗体的结合。

除了上述方法外，分子生物学技术（也是生物测定方法）也广泛应用于细胞因子或粘附分子的检测，例如PCR/RT-PCR、斑点印迹、Northern-blot和FISH。细胞或组织原位杂交等

其他免疫分析：偏振荧光检测技术；使用共焦激光显微镜；发光技术；免疫组织化学染色。这些方法在粘附分子、细胞因子及其分泌细胞的检测中发挥着积极的作用。