流式细胞仪参数测量原理

流式细胞仪是一种对细胞进行自动分析和分选的设备。它可以快速测量、存储和显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理和生化特征参数，并可以根据预选的参数范围筛选出的细胞亚群。大多数流式细胞仪都是零分辨率仪器，只能测量细胞内的总核酸、总蛋白等指标，而无法识别和测量特定部位的核酸或蛋白量。也就是说，它的细节分辨率为零。

参数测量原理

流式细胞仪可以同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号。测量是在测量区域内进行的，所谓测量区域是照射的激光束与从孔口喷出的液流束的垂直交点。当液流中心的单个细胞通过测量区域时，受到激光照射，以2π立体角向整个空间散射光。散射光的波长与入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形状、质膜和内部结构密切相关，因为这些生物参数还与细胞的光学特性有关，例如光的反射和折射。未染色的细胞具有散射光的特征，因此可以使用不同的散射光信号对未染色的活细胞进行分析和分类。当然，由于光学特性的变化，固定和染色的细胞与活细胞具有不同的散射光信号。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数有关，还与散射角、收集散射光的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用两种散射光散射方向：①前向角（即0角）散射（FSC）； ②侧向散射（SSC），又称90角散射。此时所说的角度是指激光束的照射方向与收集散射光信号的光电倍增管的轴向形成的大致角度。一般来说，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对于相同的细胞群，前向角散射光的强度随着细胞横截面积的增大而增大；对球形活细胞的实验表明，在小立体角范围内基本一致。截面积的大小呈线性；对于具有复杂形状和方向的细胞，它们可能变化很大，并应特别注意。侧向散射光的测量主要用于获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、细胞质和核膜的折射率更敏感，对细胞质中较大的颗粒也能给出敏感的反应。并且还可以对细胞质中较大的颗粒做出灵敏的反应。并且还可以对细胞质中较大的颗粒做出灵敏的反应。

实际使用时，仪器首先要测量光散射信号。当光散射分析与荧光探针结合使用时，可以识别样品中染色和未染色的细胞。光散射测量有效的用途是从异质群体中识别某些亚群体。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即细胞内部的荧光分子受光照射后未经荧光染色而发出的荧光； ②特征荧光，即荧光染料发出的荧光染料被照射后与细胞结合。荧光，其荧光强度较弱，且波长也与照射的激光不同。自发荧光信号是噪声信号，在大多数情况下会干扰特定荧光信号的分辨率和测量。在免疫细胞化学等测量中，如何提高信噪比是低结合水平荧光抗体的关键。一般来说，细胞成分中自发荧光分子（如核黄素、细胞色素等）含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞的比例越高，自发荧光越强；细胞样品中亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光的干扰，提高信噪比的主要措施有： 1、尽可能使用较亮的荧光染料； 2、选择合适的激光器和滤光光学系统； 3. 使用电子补偿电路来补偿自发荧光的背景贡献。