小分子药物聚乙二醇化方法

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的聚合物，相对分子质量为200～8000或以上。由重复的乙氧基组成，不仅具有良好的水溶性，而且易溶于苯、乙腈、乙醇等有机溶剂。 PEG分子的特点如下：

①低分散性：相对分子质量（Mr）小于5000的分散性为1.01，分子量（Mr）大于5000的分散性为1.1，具有较宽的范围。分布和更大的选择性；
②两亲性：既溶于有机溶剂又溶于水；
③无毒：研究表明大于1000的聚乙二醇无毒，已用于各种食品、化妆品和药品中；
④ 可生物降解：聚乙二醇在体内直接消除，结构不发生任何变化。分子量小于20000的代谢物可以通过肾脏代谢，较大分子可以通过消化系统代谢。

聚乙二醇化药物的特点

大多数蛋白质药物、多肽药物、化学药物都伴有一些自身无法克服的问题，如作用时间短、免疫原性大、副作用大等。 PEG呈中性、无毒，具有很好的理化性质和良好的生物相容性，是美国FDA批准用于体内注射药物的少数化学品之一。因此，通过化学方法将活化的聚乙二醇与蛋白质、肽、小分子药物和脂质体连接，即对药物分子进行聚乙二醇化，可以有效提高药物分子的生物半衰期，降低其毒副作用。可以减少影响。其中，研究最多的是蛋白质的PEG修饰。与未修饰的蛋白质药物相比，聚乙二醇化的蛋白质药物具有以下优点：

（1）生物活性更强；
（2）脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用；
(3)较长的半衰期；
(4)降低最大血药浓度；
(5)血药浓度轻微波动；
(6)酶促降解少；
(7)免疫原性和抗原性较低；
(8)毒性较小；
(9) 溶解性更好；
(10)减少用药次数；
(11)提高患者依从性，改善生活质量，降低治疗费用。

聚乙二醇化方法

鉴于聚乙二醇化对药物性质的巨大影响，聚乙二醇化已成为药物开发和提高已上市药物疗效的重要途径。因此，如何进行PEG化就成为重中之重。

首先，需要选择合适的PEG进行分子修饰。修饰剂的选择主要考虑以下5个方面：

（1）选择PEG相对分子质量（Mr）的确定应同时考虑生物活性和药代动力学因素。应用太大的聚乙二醇化蛋白药物会导致药物失去大部分生物活性。当使用低Mr（<20000）聚乙二醇化蛋白质药物时，修饰后的蛋白质药物与原型药物相比，生物活性和药代动力学性质没有本质变化。因此，一般选择40000-60000范围内的PEG作为修饰。
(2)修饰位点的选择应基于对蛋白质构效关系的分析。选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点，使得修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。常见的修饰位点有氨基修饰、羧基修饰和硫醇修饰；
(3) PEG修饰剂与氨基酸反应的特异性取决于修饰剂的化学性质和修饰位点的选择。
(4)PEG修饰剂的水解稳定性和反应活性取决于活化基团的稳定性和修饰反应条件尤其是pH值的控制。一般来说，PEG修饰剂反应活性高，因此稳定性较差，容易水解；
(5)聚乙二醇化蛋白的活性、毒性和抗原性与聚乙二醇修饰的大小和类型有关。一般情况下，随着PEG相对分子量的增加，蛋白质活性的损失逐渐增加。此外，不同的PEG修饰剂对蛋白质生物活性的影响也不同。

其次，激活PEG。聚乙二醇化蛋白质主要是通过PEG末端羟基与蛋白质氨基酸残基反应实现的。 PEG末端羟基活性较差，必须用活化剂活化才能在体内温和条件下共价修饰蛋白质。常见的PEG活化方法有：

(1)羰基二咪唑法：该方法首先用于多肽的合成，并已被证明是形成酰胺键的良好试剂。

(2)N-羟基琥珀酰亚胺法： (a)活化N，N-琥珀酰亚胺碳酸酯。该反应需要在无水条件下进行。 (B) 活化琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺。该方法得到的聚乙二醇具有较高的活性。最好在非水环境中进行蛋白质偶联。

N,N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的 PEG


琥珀酸酐和 N-羟基琥珀酰亚胺活化的 PEG

(3)氰尿酰氯法：氰尿酰氯又称三氯嗪(TST)，是一种对称杂环化合物。 David 使用 TST 与聚乙二醇上的羟基发生反应。只有一个氯原子被取代，其他氯原子与蛋白质氨基反应。

(4)光气活化法：Kurfuerst提到了由N-羟基琥珀酰亚胺钾盐、硝基苯酚、三氯苯酚与光气反应制备活化聚乙二醇的方法。激活分为两个步骤，如下图所示。

(5)聚乙二醇对蛋白质半胱氨酸残基进行化学修饰。磺基特异性修饰的常见PEG活化方法如下图所示。

(6)连接酶位点的聚乙二醇：除了传统的化学修饰方法外，还可以通过酶催化等其他方式实现修饰，以G-TGase为例。

最后选择合适的蛋白质氨基酸残基位点或小分子药物位点进行位点特异性修饰。用活化的PEG对合适的蛋白质氨基酸残基进行位点特异性修饰可以提高天然蛋白质的功效。蛋白质药物PEG修饰技术最大的问题是无法实现位点特异性修饰，修饰产物不均一，给分离纯化带来很大困难，也极大阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点，科学家在使用PEG进行修饰时，选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点。这样，修饰后的蛋白质药物除了具有聚乙二醇化带来的优异性能外，还具有较高的生物活性。目前上市药物中常见的修饰位点包括氨基、羧基、磺基、二硫基、糖基以及非极性氨基酸的一些特定位置。