DNAstorm™ FFPE 套件常见问题

使用 DNAstorm™ 试剂盒获得的 DNA 中是否存在污染 RNA？

通过在裂解步骤后立即执行优化的 RNase 消化步骤来消除 RNA 污染。

我预计可以从 FFPE 样本中获得多少 DNA？

影响获得的 DNA 总量的最大变量是样本本身的质量（即组织的类型和数量，以及样本分离和保存的注意事项）。使用 DNAstorm™ 试剂盒，并假设样品质量至少合理，可以获得大于 1 µg 的量。

使用 DNAstorm™ 试剂盒获得的 DNA 可以用于下一代测序吗？

是的。只要 DNA 的质量足够高，就可以获得高质量的文库。

组织应该如何准备？

使用切片机从 FFPE 样品中获取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用小于 5 µm 的切片。不建议使用厚度超过 10 µm 的切片，因为它们可能无法全消化。

我可以使用非石蜡包埋的组织吗？

是的，可以使用未包埋在石蜡中的组织。在这种情况下，我们建议机械研磨相当于推荐切片数量的组织。

我可以使用 FFPE 芯吗？

是的，可以使用 FFPE 芯材。由于核心不使用切片机进行处理，因此样品消化往往更加困难，如果观察到消化不全，建议使用机械均质化（例如使用钢珠）。

您推荐哪种脱蜡方法？

DNAstorm™ 试剂盒包含推荐的脱蜡试剂。与其他常见方法（例如二甲苯）不同，脱蜡试剂高效、无毒，并且不需要使用通风柜。在我们的测试中，所包含的试剂在去除石蜡和纯化高质量核酸方面至少与二甲苯一样有效。

将脱蜡试剂与 CAT5 裂解缓冲液混合后，我看到脱蜡试剂层和水层之间有白色混浊层。这是什么以及它如何影响提取？

白色混浊层是脱蜡试剂和 CAT5 裂解缓冲液之间的乳液，当这两种试剂涡旋或硬混时可能会形成。为避免此问题，我们建议在脱蜡试剂和 CAT5 裂解缓冲液接触时不要涡旋样品。当需要在这两种试剂存在的情况下混合时（例如添加蛋白酶时），我们建议使用移液器混合。通过以最大速度 (> 16,000 xg) 强力旋转样品至少 2 分钟，可以去除白色浑浊层。时间长短取决于乳液的体积。

如何评估我获得的 DNA 的完整性？

由于从 FFPE 组织样品中分离出的 DNA 尺寸分布广泛，我们建议使用脉冲场凝胶电泳 (PFGE)。也可以使用基于毛细管电泳的方法，例如安捷伦生物分析仪，但可能无法正确解析质量较好的样品中的高分子量片段（大于 10k）。

为什么我提取的 DNA 无法正常扩增？我注意到很多 PCR 抑制和/或 Ct 值毫无意义。

当使用大量 FFPE 提取的模板 DNA 时，经常会观察到 PCR 抑制。这种抑制通常不是由于污染物的存在，而是由于 DNA 本身的残留化学修饰和损伤造成的。对 PCR 方案进行一些简单的调整就可以解决这个问题。首先，应减少模板DNA的量。其次，PCR 聚合酶的量应增加 2-4 倍。第三，应延长退火和延伸时间。第四，可以增加dNTP的量。