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随着反相快速色谱法在反应混合物纯化中的使用增加，出现了很多问题，因为许多化学家不像正相或硅胶柱色谱法那样熟悉这项技术。化学家提出的问题之一是关于 pH 调节剂（特别是酸）的使用及其纯化。
在反相占主导地位的 HPLC 领域，通常使用酸（甲酸、乙酸等），通常浓度为 0.1%。其基本原理是，如果样品成分在溶液中可电离，则其色谱保留和峰形可能会受到影响，并且其定量也会受到挑战。
电离/可电离化合物在溶液中时在带电状态和中性状态之间保持平衡。这些分子在中性溶剂系统中进行色谱分析时，可以显示为前峰（想想滑雪坡），因为电离部分比中性状态更易溶于水，因此洗脱得更快。添加 pH 调节剂，无论是酸还是碱，都可以迫使平衡全进入中性状态或进入电离状态。当全电离时，化合物会提前洗脱；当中性时，该化合物更具疏水性，并且其在柱上的保留增强。
例如，我们来看看通过琥珀酸酐和 α-甲基苄胺的微波反应生成的合成 N-(1-苯乙基)琥珀酰亚胺的纯化，如图 1 所示。
图 1. 使用 Biotage® Initiator+ 微波反应器进行琥珀酸酐与 α-甲基苄胺的反应
当使用中性溶剂纯化时，产品前沿很差，表明它处于电离态和中性态之间的平衡，图 2。
图 2. 使用中性水和乙腈的反应混合物反相快速色谱显示前沿产物峰。
产品作为非高斯前沿峰洗脱的问题是，它是一个宽广的峰，并且收集在多个柱体积 (CV) 中。这意味着收集的产物被稀释在比典型或期望更多的溶剂中，这增加了蒸发馏分溶剂的体积和时间，并增加了较低纯度和回收率的可能性。事实上，该反应混合物中存在较早洗脱的副产物，其污染了早期产物级分。是的，这些馏分可以被丢弃，但这会降低回收的产品产量，这不一定是理想的解决方案。
通过将酸（在本例中为0.2%冰醋酸）引入到水和乙腈中，可电离的反应混合物组分质子化。质子化产物的洗脱带减少（锐化），从而增加了其浓度以及与污染副产物的分离，图 3。副产物也质子化，导致其比中性流动相更早洗脱。结果是大大改善了分离，产物以更集中的谱带洗脱，并且与副产物的分离度更高。
图 3. 使用酸化溶剂系统纯化反应混合物，使产物峰尖锐并降低干扰副产物的保留。
然而，化学家在使用 pH 值修改的流动相时需要小心，因为潜在的化合物保留随 pH 值变化而变化。在前面的例子中，电离化合物移动是有帮助的，但质子化化合物并不总是朝着有利的方向移动。当 pH 值发生变化时，洗脱的化合物可能会相互靠近甚至共洗脱。
我们可以看到这种情况发生在由靛红酸酐和 α-甲基苄胺微波反应生成的合成产物 2-氨基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺中，图 4。
图 4. 靛红酸酐与 α-甲基苄胺的微波反应
当使用中性水/甲醇梯度纯化时，我们可以看到一些极性副产物在产品之前洗脱，以及强烈保留的副产物在产品后面以 9.5 至 14 CV 之间的宽峰形式洗脱，图 6。
图 6. 反应混合物的 pH 中性反相快速色谱
在两种洗脱溶剂中添加 0.2% 冰醋酸后，洗脱化合物的保留率发生显着变化。副产物在中性 pH 值下以 4 CV 洗脱，在酸性条件下离子化并以 1.5 CV 洗脱。尾随的疏水性副产物也电离并移近产物，图 7。
图 7. 使用酸化水/甲醇梯度纯化反应混合物，改变了两种副产物的保留。
随着产物和尾随副产物之间分辨率的降低，该反应纯化的负载能力降低，这意味着需要更大的柱（和更多的溶剂）来充分纯化反应产物。
因此，虽然流动相 pH 值调整有助于改善纯化，但请注意，洗脱体积和选择性可能会发生变化，从而可能降低纯化效率。
用于创建此数据的设备包括：
Biotage®引发剂+微波反应器
Biotage® Selekt Single 快速色谱系统
Biotage® Sphere C18 色谱柱，12 克
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