蛋白质印迹 (WB) – 实验方案

蛋白质印迹是一种常用的分子生物学技术，用于分析样品中感兴趣的蛋白质。细胞裂解物由细胞培养物裂解产生，并在凝胶电泳 (SDS-PAGE) 中按重量分离。然后这些蛋白质从凝胶转移到膜上，在膜上它们被封闭并用特异性抗体探测以检测感兴趣的蛋白质。借助灵敏且特异的抗体，可以轻松检测小样品中的修饰蛋白质或未修饰蛋白质。

协议：

1. 在封闭液（TBST 中的 5% 脱脂牛奶（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.6）中振荡孵育 1 小时，封闭膜。

注意：对于磷酸化特异性抗体，使用封闭液中的 5% BSA。

2. 在封闭液中以适当的稀释度稀释一抗。

3. 将膜与稀释的一抗在 40°C 下搅拌孵育过夜。

4. 去除抗体溶液。室温下在 TBST（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20、pH 7.6）中摇动洗涤膜 3 次，每次 5-10 分钟。

注意：将 Tween-20 浓度增加至 0.1% 可降低背景并提高特异性，但会降低灵敏度。

5. 将膜与在封闭液中稀释（根据制造商说明）的二级 AP 或 HRP 缀合物一起在室温下振荡孵育 1 小时。

6. 按照步骤 4 清洗膜。

7. 在进行化学发光反应之前，用 TBS 清洗膜 2-5 分钟。

8. 根据制造商的说明制备和使用化学发光底物（用于 AP 或 HRP）。

9. 立即包裹膜并在 X 射线胶片下曝光 10 秒至 1 小时。暴露时间可能根据抗体和抗原的量而变化。或者放入成像仪中并进行相应调整。