免疫组织化学 (IHC) – 实验方案

免疫组织化学是免疫染色在组织学中的重要应用。它需要使用与生物组织中的这些抗原结合的抗体来特异性检测细胞中的抗原。组织样本通过石蜡包埋或福尔马林固定方法固定，并用抗原修复剂进行预处理。预处理对于通过破坏福尔马林诱导的抗原交联来改善抗原的表达至关重要。然后封闭载玻片以减少背景，并可以通过直接标记或间接测定进行染色。

脱蜡

1. 将载玻片在 60°C 孵育 60 分钟。

2. 在二甲苯中脱蜡 10 分钟，然后再重复一次。

3. 在 100% 酒精中水合 5 分钟，然后在 95% 酒精中水合 5 分钟，然后在 85% 酒精中水合 5 分钟，然后在 75% 酒精中水合 5 分钟。

4. 浸入蒸馏水中5分钟

5. 浸入 TBS（50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.6）中，放置 5 分钟，然后重复两次。

抗原修复

1. 将 500-2000 ml 10 mM 柠檬酸盐缓冲液 (pH6.0) 在不锈钢高压锅中煮沸。

2. 将载玻片放入染色架中，然后放入高压锅中，确保载玻片充分浸入柠檬酸盐缓冲液中。

3. 3-4 分钟后，当压力指示阀上升时，孵育 1 分钟。

4. 将载玻片自然冷却至室温。

5. 浸入蒸馏水中，放置 5 分钟，重复两次。

6. 将载玻片浸入 TBS 中 5 分钟，然后重复两次。

7. 在室温下将载玻片浸入 3% H2O2（新鲜甲醇中）15 分钟。

8. 用蒸馏水清洗两次，每次5分钟。

9. 用TBS（pH 7.6）洗涤两次，每次5分钟。

一抗染色

1. 用 TBS 中的 3% BSA 稀释一抗。用稀释的一抗覆盖载玻片上的组织切片（每张载玻片使用 50-150 μl）。

2. 37℃孵育30分钟或室温60分钟（最佳孵育时间、孵育温度和抗体稀释度应由各个实验室确定）。

3. 用TBS洗涤两次，每次5分钟。

二抗染色

1. 与 100-200μl 聚合物增强剂一起孵育 37C 孵育 30 分钟

2. 用TBS洗涤3次，每次5分钟。

3. 与 100 200μl 聚合 HRP 一起孵育，并在 37C 下孵育 30 分钟

4. 用TBS洗涤3次，每次5分钟。

5. 加入dAb溶液，孵育3-10分钟（反应进度和最佳时间应根据显微镜确定）。

6. 用蒸馏水清洗2次，每次5分钟。

7. 如果需要，用苏木精复染切片，用蒸馏水清洗。将玻片浸入 0.1% HCl 乙醇中 1-10 秒，用蒸馏水清洗。

8. 95%乙醇脱水1分钟，100%乙醇脱水2×3分钟，二甲苯脱水2×3分钟，盖玻片封固剂。