细菌保存指南：冷藏、冷冻和冷冻干燥

在原种培养物、突变菌株和基因工程变体之间，任何一个实验室可以积累的单个细菌培养物的数量可能很多。事实上，在设计一个质粒的过程中产生的变异数量可能是惊人的。大多数实验室都会保留所有这些和其他变化，因为你永远不知道明天可能需要什么。因此，保存所有这些细菌培养物和遗传变异是需要深思熟虑的事情。 

加盖试管中的细菌培养物处于封闭环境中。尽管培养物开始时可能是健康的，但随着时间的推移，活细胞的数量将减少到零。保存培养物的目的是降低死亡率，以便在重新进行培养物时，一些细胞仍然存活并可用于培养。细胞死亡的原因可能有很多，但在每种情况下都是基于细胞及其环境的固有化学性质。如果有害的化学反应可以减慢或停止，那么整个培养物将在更长的时间内保持活力。   

有两种基本方法可以减缓细菌培养物中有害反应的速度。第一个是降低温度，从而降低所有化学反应的速率。这可以使用冰箱、机械冷冻机和液氮冷冻机来完成。第二种选择是从培养物中去除水，这个过程可能很棘手，并且涉及使用冻干机升华水。   

以下是保存细菌的主要选择的简要讨论。报告了每个选项的优点和缺点。 

冷藏

细菌在 4°C 下可以短暂存活。对于每天或每周使用的菌株，在琼脂斜面或平板上生长的培养物可以储存在冰箱中，前提是已采取预防措施以避免污染。应使用标准技术制备培养物，然后在储存前密封。对于倾斜，我们建议使用螺旋盖管。对于培养皿上的培养物，需要用封口膜密封培养皿。密封板不仅有助于防止霉菌潜入板中，而且还能减缓琼脂的干燥速度。对于超过一周或两周的情况，培养物可以以刺的形式储存在小平底螺旋盖小瓶中。在该技术中，小瓶中充满少量琼脂培养基（例如1ml）并灭菌。然后用无菌针将细菌引入固化的琼脂中。将培养物用松盖孵育过夜，然后用紧盖保存在 4°C 下。储存在刺棒中的培养物更能抵抗干燥和污染，但它们会比冷冻储存更快地失去活力。刺伤可以保持活力的时间长度取决于应变。一些手册声称刺针可以使用一年，但除非经过测试，否则做出这种假设是不明智的。刺伤可以保持活力的时间长度取决于应变。一些手册声称刺针可以使用一年，但除非经过测试，否则做出这种假设是不明智的。刺伤可以保持活力的时间长度取决于应变。一些手册声称刺针可以使用一年，但除非经过测试，否则做出这种假设是不明智的。 

冷冻

冷冻是储存细菌的好方法。一般来说，储存温度越低，培养物保留活细胞的时间越长。冷冻柜可分为三类：实验室冷冻柜、超低温冷冻柜和低温冷冻柜。储存在冰箱中的细菌（和其他细胞）面临的问题是冰晶。冰会因局部盐浓度增加导致脱水而损害细胞。当水转化为冰时，溶质积聚在残留的游离水中，这种高浓度的溶质会使生物分子变性。冰也会使细胞膜破裂，尽管这个问题通常与缺乏细胞壁的细胞有关，例如培养的动物细胞。为了减轻冷冻的负面影响，甘油经常被用作冷冻保护剂。许多鱼类和昆虫都会产生甘油，通过降低细胞的冰点、增强过冷以及防止结冰来抵御寒冷的温度。对于细菌，添加甘油至终浓度 15% 将有助于保持细胞在所有冷冻条件下存活。以下是每个冷冻机类别的一些具体信息。 

实验室冷冻柜可以将温度降低至 -20 至 -40°C。这些是单级系统（一台压缩机），通常称为通用冷冻机。细菌可以在通用冰箱中保存中等时间，例如1年。最好使用没有无霜温度循环的冰箱，因为这会对细胞和其他温度敏感的生物分子造成严重破坏。通用冰箱价格便宜，在大多数实验室都有，因此它们很容易用于储存培养物。缺点是它们的温度不够低，无法长期储存。 

超低温冰箱是两级系统（两个压缩机，每个压缩机具有不同的制冷剂），可降至 -86°C 左右。超低温冰箱非常普遍，但其中的空间有时可能有限且竞争激烈。超低温冰箱的购买、运行和维护成本也高得多。好处是，储存在 -80°C 下的细胞往往可以保持存活数年。超低温冰箱产生的较低温度大大减少了培养物内的化学反应。然而，冷冻细胞中仍然发生分子运动，因此培养物的活力将会下降。定期监测培养物以评估其生存能力非常重要。   

低温冷冻柜非常冷，依靠液氮或专门的机械系统来运行。对于生物样品，低温储存应低于-130°C。在此温度下，水的分子运动停止，细胞被困在玻璃状基质中。储存在低温冰箱中的细菌可以保持其活力多年。在我们的实验室中，细菌和酵母培养物已在 -140°C 下保存 15 年，活力没有明显丧失。与冷冻干燥相比，在低温冰箱中储存细胞是有效且简单的长期储存方法。其缺点是成本以及库存对停电、机械故障和液氮交付失败的潜在脆弱性。此外，管子切勿存放在浸没液氮的罐中。螺旋盖管泄漏，会将氮气和污染物一起吸入管中。液氮气相冷冻机将有效地避免这个问题，但这些冷冻机非常昂贵（高达1万美元）并且需要大量液氮。另一种选择是机械低温冷冻机，温度可低至 -150°C，但购买成本也非常昂贵（约 2 万美元）。两台低温冷冻机的运行费用每月为数百美元。但这些冷冻机非常昂贵（高达 1 万美元）并且需要大量液氮。另一种选择是机械低温冷冻机，温度可低至 -150°C，但购买成本也非常昂贵（约 2 万美元）。两台低温冷冻机的运行费用每月为数百美元。但这些冷冻机非常昂贵（高达 1 万美元）并且需要大量液氮。另一种选择是机械低温冷冻机，温度可低至 -150°C，但购买成本也非常昂贵（约 2 万美元）。两台低温冷冻机的运行费用每月为数百美元。   

冷冻干燥

在水系统（例如活细胞）中，水不仅充当酶促反应的介质，而且还充当自发的负面反应（例如自由基形成）。除去水会停止酶促反应和非酶促反应。冷冻干燥是去除这种水的一种方法。通过冷冻干燥可以非常有效地保存许多细菌。通过将细胞冷冻在含有冻干保护剂（通常是蔗糖）的介质中，然后使用真空吸出水（升华），可以有效保存细胞。这种方法很费力，需要专门的设备，但它的优点是可以产生不受停电和空液氮罐影响的原种培养物。此外，如果培养物定期运送到其他实验室，冻干培养物不需要特殊处理。冷冻干燥的缺点是并非所有培养物都以相同的方式反应，因此需要进行一些实验来优化每种菌株的工艺。对于任何认真生产和维护培养物保藏的实验室，冷冻干燥应作为主要的保存方法。