炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质与染料叠氮化物或炔烃的缀合

蛋白质标记缓冲液适用于 CuAAC 与蛋白质的反应，可保护生物分子免受活性氧的损害。该反应可用于具有炔烃或叠氮基团的蛋白质，以及用叠氮基团代谢标记的细胞或细胞裂解物的组分。

叠氮化物与末端炔烃缀合，形成五元杂环（1,2,3-三唑）。这两个基团（叠氮基和炔烃）在天然生物分子中都极为罕见，因此该反应具有高度特异性，可以有效地处理各种任务。

该反应在铜 (I) 化合物存在下进行，几乎不依赖于 pH 值。蛋白质标记缓冲液针对蛋白质操作进行了优化，含有铜 (II) 盐（催化活性铜 (I) 化合物的稳定前体）、醋酸三乙铵 pH 6.8、水溶性 THPTA 配体和氨基胍。建议使用新鲜配制的 抗坏血酸溶液减少铜(II)。蛋白质标记缓冲液中的 THPTA 配体通过稳定铜 (I) 的催化活性化合物来加速反应。 THPTA 配体的存在还允许在水介质（无有机溶剂）中进行蛋白质标记，并且由于铜 (I) 氧化程度的稳定，最大限度地减少活性氧 (RAS) 的产生，并防止它们通过氧化组氨酸、蛋氨酸来损坏蛋白质和半胱氨酸。蛋白质标记缓冲液中的氨基胍可防止化学反应性醛（脱氢抗坏血酸水解产物）与精氨酸、N 末端半胱氨酸和赖氨酸的侧链结合。

对于此反应，您将需要无叠氮钠缓冲液中的炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质、叠氮染料或 炔烃、1.5х蛋白质标记缓冲液和抗坏血酸。建议在惰性气体（氮气或氩气）下执行步骤 6 至 9。

协议

我们推荐以下方案用于修饰蛋白质与染料衍生物的缀合：

1. 根据要使用的修饰蛋白的量确定总反应体积：

   ！炔烃或叠氮化物修饰的蛋白质溶液的体积不应超过总反应体积的1/3。

   总反应体积，μL	蛋白质含量
   100	4至20纳摩尔
   200	20至40纳摩尔
   400	40至80纳摩尔
   600	80 至 600 纳摩尔

2. 使用下表计算标记反应的试剂体积：

   试剂	体积，微升	原液浓度
   染料叠氮化物或炔烃	（蛋白质含量 [nmol]）× 0.3*	10 mM DMSO 或水
   蛋白质标记缓冲液	（总反应体积[μL]）×0.67	1.5倍
   活化剂（抗坏血酸）	（总反应体积[μL]）×0.02	50 mM 水中
   水	（总反应体积 [μL] – 染料溶液体积 [μL] – 蛋白质标记缓冲液体积 [μL] – 活化剂溶液体积 [μL]）	—

   * 染料过量可能会根据蛋白质分子上叠氮化物或炔基的数量而变化。表中显示的计算结果为 3 倍过量的染料。对于 1.5–10 倍过量的染料，将蛋白质含量 (nmol) 乘以 0.15–1。但请记住，如果您使用不溶于水的叠氮化物或炔烃，则过量时它可能会从反应混合物中沉淀出来。使用水溶性染料，例如磺化花青染料sulfo-Cyanine。

3. 准备 染料叠氮化物或炔烃（10 mM 溶于 DMSO 或水中，适用于水溶性炔烃和叠氮化物）和活化剂（抗坏血酸，50 mM 水溶液）的储备溶液。

   请记住，抗坏血酸在空气中很容易氧化。仅使用新配制的活化剂溶液 （该溶液在 1 天内稳定）。要制备储备溶液，请将 10 mg 抗坏血酸溶解在 1.1 mL 水中。

4. 将蛋白质标记缓冲液添加到修饰的蛋白质溶液中并涡旋。

5. 添加计算体积的叠 氮化染料或炔烃储备溶液，并再次涡旋均匀。

6. （推荐）对混合物进行脱气以除去氧气。为此，将一次性移液器吸头连接到塑料或硅胶管，该管连接到装有惰性气体（氩气或氮气）的气瓶的压力调节器。打开非常弱的气流，放入管中，使其比液面高 3-10 毫米，避免接触液体和管壁。气流应在液体中形成漩涡而不溅出液体。将保持在该位置 10-20 秒。

   如果同时进行多个标记反应，可以使用离心浓缩器进行脱气。为此，将管子放入浓缩器中，打开旋转，打开真空 30-40 秒，然后关闭真空，同时向系统输入端输送惰性气体。

7. 添加活化剂溶液（抗坏血酸），然后用惰性气体吹扫管几秒钟并关闭它。

8. 涡旋溶液。

9. 让混合物在室温下静置 8-16 小时。

10. 使用透析或尺寸排阻色谱分离染料-蛋白质缀合物。