使用Elisa试剂盒检测细胞因子的最终指南

在现代生物技术中，当确定生物样品中抗原、抗体、肽、蛋白质、激素或其他生物分子的存在和数量时，酶联免疫吸附测定(ELISA)被广泛使用。由于其高灵敏度，它甚至可以识别最小的抗原浓度。

ELISA的敏感性归因于其识别单一抗原-抗体复合物之间相互作用的能力。

Elisa试剂盒在持续的变化中的医学研究和诊断领域。由于其非凡的准确性和适应性，这些试剂盒对于解决医学谜题和研究新的治疗方法是需要的。随着科学好奇心和技术进步，它们的使用已经扩展到包括从传染病到癌症生物标记识别的各个领域。他们每天都有新的突破，帮助改善病人护理和革命性的医学进步。

酶联免疫试剂盒在细胞因子检测中的应用

这ELISA技术包括各种免疫测定，它们的程序几乎没有区别。几个参数，例如被检测的抗原、可用于特定抗原的单克隆抗体以及必要的测试灵敏度，决定了使用哪种版本的ELISA。夹心法和间接ELISA是细胞因子检测中常用的两种方法。

1.夹心ELISA

细胞因子夹心ELISAs是敏感酶免疫测定其可以精确地鉴定和测量可溶性趋化因子和细胞因子蛋白的量。高纯度的抗细胞因子抗体(捕获抗体)用于基本的细胞因子夹心ELISA方法。这些抗体非共价吸附在塑料微孔板上。固定的抗体用于选择性地结合在样品中发现的可溶性细胞因子蛋白，所述样品在洗板后加入到板上。

去除未结合的物质后，使用生物素偶联的抗细胞因子抗体(检测抗体)来鉴定已经收集的细胞因子蛋白。随后是酶标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白步骤。

一；一个ELISA阅读器可用于在加入生色底物后，在可接受的光密度(OD)下，通过分光光度法简单地定量由结合的酶联检测试剂产生的有色产物的量。当板阅读器连接到计算机时，数据存储和再分析变得更容易。

这ELISA夹心法是高精度测量分析物的方法。这种形式可以揭示分析物的特异性和灵敏度，从固定分析物的捕获抗体开始。当加入带有酶标记的检测抗体时，三明治就像积木一样组装起来了。它通过识别分析物上的额外表位来完成复杂的三明治结构。

2.间接ELISA

间接ELISA是一种二级结合抗体鉴定一级抗原特异性抗体的方法。抗体测序协调间接Elisa中的灵敏度和信号放大。在这种结构中，两种抗体协同工作来击败分析物。具有高特异性的第一抗体寻找分析物并形成不可逆的结合。

第二抗体然后使用酶标记来识别并将其自身附着到原始抗体上。两种抗体协同作用，增强了信号，提高了灵敏度，即使是极微量的分析物也能突显出来。

当用于细胞因子检测时，间接ELISA的灵敏度高。这主要是因为第一抗体可以附着许多与酶结合的第二抗体。此外，一种酶偶联的二抗可以识别多种一抗。这为用户提供了根据需要在几个ELISA中使用相同的酶偶联的第二抗体的选择(独立于被检测的抗原)

选择合适的ELISA试剂盒

考虑以下因素将有助于您的ELISA试剂盒发挥最佳性能:

1.抗体的特异性

这为ELISA测试选择抗体取决于特异性和亲和性标准。根据定义，单克隆抗体结合更精确，减少了背景信号。多克隆和单克隆可以一起使用，也可以分开使用。尽管多克隆会产生更高的信号，但非特异性结合也会更普遍。您还需要每次都进行广泛的测试，因为多克隆会表现出更多的批次间差异。

术语“配对"描述单克隆抗体、多克隆抗体或两种抗体的混合物，用于在实验中检测单一抗原。这些抗体应该已经通过与几个表位结合并作为有效的“捕获"和“检测"对而表现出良好的功能。

2.灵敏度和检测范围

每个ELISA试剂盒都设计用于检测不同的目标，并具有好的功能；它们不是普遍适用的。了解您的ELISA试剂盒的灵敏度和特异性，以及每一步的精确增强，将提供准确可靠的标准曲线，显示您目标的测量结果。

每个包装中将包含针对每个目标定制的试剂和ELISA缓冲液。在测试开始时，确保您了解每组参数，如抗体类型、孵育持续时间、温度和报告系统。如果你事先熟悉这一点，它会节省你大量的时间和烦恼。

3.样本兼容性

了解特定的ELISA试剂盒是否与您的样品组成(基质)相容(或不相容)。试剂盒的性能通常使用各种矩阵进行评估，结果经常出现在说明书和其他辅助材料中。确保您了解ELISA试剂盒在样本(尿液、组织培养、血浆、血清等)的基质中的描述。).虽然这并不一定意味着试剂盒不起作用，但它将有助于了解您是否需要更多的验证分析来确定它在您的兴趣矩阵中的表现如何。

4.验证和质量控制

使用质控样本在以下位置进行一些测试生成标准曲线的各种稀释度充分利用你的装备。当你知道合适的稀释度时，保存好你的样品。在了解要使用的样品和稀释液后，您可以有效地安排您的样品板。确保按照试剂盒的说明使用所有孔。如果根据给出的信息需要额外的检测试剂，请添加。

实验协议

在生成有价值和有意义的数据时，以准确性和可重复性为目标。始终牢记ELISA方案，以确保一致性、最佳性能和精确结果。以下是需要考虑的实验方案:

• 在开始实验之前，给试剂盒试剂大约30分钟的时间，使其达到室温或规定的温度。
• 此外，冷冻样品必须全解冻，冻融循环次数应保持在低水平，不超过三次。
• 在实验期间和实验之间保持一致的环境条件，如温度和湿度。
• 确保每一件设备，如阅读器、

  洗板机和移液器已校准.

• 使用足够的抗体。
• 使用新制备的底物溶液，在使用前储存数小时。
• 在测试过程中，始终如一地处理样品，并遵守相同的方案。
• 在操作过程中目视检查吸头和孔，以确保吸取、试剂添加和提取。水平应该是一样的。
• 为了更好地利用您的试剂，请在ELISA检测中混合批次。每个ELISA试剂盒被组装成使得组件作为一个单元起作用。测试之间的大量混合可能会对结果产生负面影响。
• 试剂一旦使用，切勿放回瓶中。
• 测试后，保持托盘关闭，以防止孔变干。

成功检测细胞因子的技巧

1.样品制备

在开始你的主要实验之前，用一个小样本来确定合适的稀释范围。您的样本必须符合微量滴定板测试的格式。被检测的生物标记物的数量总会有变化。

由于您正在寻找符合样品标准曲线的数据，请使用试剂盒说明作为指南。请注意，含有胆红素或其他干扰因素的样本会导致错误的结果。以下样品可用于ELISA试剂盒:细胞裂解物、血清、唾液、血浆和细胞培养上清液。

2.已知浓度的滴定标准

确定浓度的滴定ELISA标准对于任何ELISA都是不可少的，因为它们使用户能够确定抗原浓度在测试样本中。为了建立标准曲线，通常要留出一系列的孔，并加入已知量的a将纯化的重组蛋白逐渐加入孔中.

然后，当这些孔与测试样品同时处理时，用户可以从酶标仪获得已知蛋白质浓度的一组参考吸光度值，以便与测试样品的吸光度值一起使用。

之后，您可以计算标准曲线，与测试样品进行比较，以确定所需蛋白质的浓度。也可以使用标准曲线来验证用户进行稀释的准确度。

3.添加底物

孔中酶的量与ELISA底物被转化为产品。最常见的附着在抗体上的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。正如可以假设的那样，可以获得针对每种酶定制的产生荧光或生色产物的各种底物。

此外，底物具有多种灵敏度，这可能会提高检测的总灵敏度。当选择合适的底物和酶偶联抗体时，您还必须考虑在实验结束时读取ELISA板的设备。

4.检测和分析

一种计算ELISA灵敏度的常规方法是选择产生比平均背景信号值高至少两到三个标准偏差的信号的*低浓度的细胞因子。

特定的细胞因子和趋化因子蛋白存在于混合的细胞因子环境中，例如刺激的淋巴细胞培养上清液。因此，由于检测抗体信号的酶介导的扩增，夹心ELISA可以定量这些蛋白质的生理相关量。

如何分析ELISA数据

1.成绩统计

在ELISA过程中，未知样品的值通过与标准曲线进行比较来确定。在样品稀释的情况下，稀释系数需要乘以从标准曲线获得的浓度值。ELISA样品应总是一式三份或两份，以提供具有足够数据的结果进行统计验证。

对于每个标准品、对照品和样品，计算两次或三次测量值的平均值，并减去平均零标准光密度(OD)。重复数据的变异系数(CV)不应超过20%。

2.标准曲线

使用计算机软件绘制平均吸光度对蛋白质浓度的曲线，以创建标准曲线。确保您遵循ELISA试验协议建议的数据简化技术。

已知浓度的标准细胞因子蛋白质溶液被连续稀释以产生标准曲线，该标准曲线被添加到夹心ELISA测试中。这些标准曲线也称为“校准曲线"它们通常是通过将标准细胞因子蛋白浓度(通常表示为ng或pg细胞因子/ml)对相应的重复平均OD值作图而得到的。

可以从标准曲线推断出可疑的含细胞因子样品的浓度。ELISA计算机软件程序有助于这一操作。为了确保OD位于标准曲线的线性区域内，请确保对未知样品进行一系列稀释。研究人员可以选择对他们的数据进行各种曲线拟合分析，如线性对数、对数对数或四参数转换，这取决于所用的ELISA试剂的种类。

如果软件不可用，可通过在线性标度上绘制浓度记录与OD记录的图表，使ELISA数据分析线性化。回归分析可用于找到最佳拟合线。该过程将产生足够的但不太精确的数据拟合。

3.计算变异系数

变异系数(CV)描述了标准偏差与平均值的比率，通常用百分比表示。CV计算至关重要，因为它可能会揭示ELISA数据中的任何差异或错误。重复数据的变异系数(CV)不应超过20%。更高的简历意味着更多的不准确和潜在的错误。

ELISA常见问题的故障排除

每种ELISA都有一定的缺点。首先，测试样本中存在多少目标蛋白质的问题。如果数量过高或过低，酶标仪产生的吸光度读数可能会分别超出或低于标准曲线的极限。因此，估计测试样品中蛋白质的精确数量将是一个挑战。

如果读数非常高，在将测试样品放入板的孔中之前稀释它。根据稀释系数，必须修改最终数字。DIY试剂盒有时需要仔细优化抗体浓度，以获得良好的信噪比。

结果

各种ELISA技术已被改进，以定量分析不同实验标本中的抗原水平。然而，它们背后的基本思想都是一样的。在选择是采用间接ELISA还是夹心ELISA时，待检样品的复杂性和抗原特异性抗体的可用性是关键考虑因素细胞因子检测.

当确定免疫反应的结果时，例如计算样品中抗体的含量，可以使用间接ELISA。当检查复杂样品时，其中分析物或靶抗原存在于混合样品中，如组织裂解物或培养上清液，夹心ELISA是最合适的方法。