人血管内皮生长因子(VEGF)ELISA

人血管内皮生长因子(VEGF)ELISA，产品编码：JYM0103Hu

人血管内皮生长因子(VEGF)ELISA，Human vascular endothelial growth factor (VEGF)ELISA Kit

产品描述：

【实验方法】双抗体夹心法

【种属】人

【检测范围】 见说明书

【检测波长】450 nm

【样本类型】血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本

【反应时间】 1.5~2h

人血管内皮生长因子（VEGF）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供科研使用。

本试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中血管内皮生长因子（VEGF）的含量。

有效期：6个月

保存条件：2-8

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人血管内皮生长因子（VEGF）水平。用纯化的人血管内皮生长因子（VEGF）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血管内皮生长因子（VEGF），再与HRP标记的血管内皮生长因子（VEGF）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血管内皮生长因子（VEGF）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人血管内皮生长因子（VEGF）浓度。

试剂盒组成

样本处理及要求

1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷         冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS           （PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/          分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不           能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分         别加标准品 100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50μl，混匀；然后          从第一孔、第二孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分        别加标准品稀释液 50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各        取 50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释50ul，        混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第             七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取 50μl         加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50μl，混匀后从第九       第十孔中各取 50μl 弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50μl，浓度分别为                       300pg/ml, 200pg/ml, 100pg/ml, 50pg/ml , 25pg/ml。）

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、         待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待           测样品10μl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不         触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 加酶：每孔加入酶标试剂 50ul，空白孔除外。

4. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

5. 配液：将 30(48T 的 20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30(48T 的 20 倍)倍稀释后备         用。

6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，        如此重复 5 次，拍干。

7. 显色：每孔先加入显色剂 A50ul，再加入显色B50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显        色 10 分钟.

8. 终止：每孔加终止液 50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9. 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

注意事项

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封        后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时          间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本          OD值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n             倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物请避光保存。

7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9. 本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准.

计算

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能

1. 样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.92 以上。

2. 批内与批间应分别小于 9%和 15%

检测范围

5pg/ml -400pg/ml

上海牧荣生物科技有限公司

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