jenabioscience:高保真荧光素PCR标记试剂盒——PCR法制备荧光素标记的DNA探针

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一组科学家于1998年成立，利用超过25年的学术知识为100多个国家的研究和行业客户开发创新试剂。

供一般实验室使用。

运输:凝胶包装运输

储存条件:储存在-20°C
避免冷冻/解冻循环，避光储存

保质期:12个月

光谱特性: λexc492纳米，λ全身长的517纳米，ε 83.0毫摩尔-1厘米-1(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 7.5)

描述:
高保真荧光素PCR标记试剂盒设计用于通过PCR随机产生荧光素修饰的DNA探针。这种探针非常适合荧光原地的杂交(FISH)和Northern印迹实验。如果模板量有限或需要扩增特定的DNA片段，基于PCR的标记优于用Klenow片段的随机引物标记。高达4kb的探针扩增是可行的。

使用优化的反应缓冲液和高保真聚合酶混合物，荧光素-12-dUTP作为其天然对应物dTTP的替代物被有效地掺入到DNA中，所述高保真聚合酶混合物包括Taq聚合酶和校对酶。50 %荧光素-12-dUTP取代通常导致反应和标记效率之间的最佳平衡。然而，荧光素-12-dUTP/dTTP比率的个体优化可以容易地用单核苷酸形式实现。

该试剂盒包含足够的试剂，可用于10次标记反应(S-Pack)或50次标记反应(L-Pack)，每次20μL(50%荧光素-12-dUTP替代，100微米dATP/dGTP/dCTP，50微米dTTP，50微米荧光素-12-dUTP)。

内容:
高保真聚合酶
在含有50%甘油(v/v)的储存缓冲液中
# APP-101-FAMX-S:1个40微升(100个单位，2.5个单位/微升)
# APP-101-FAMX-L:2个40微升(2个100单位，2.5单位/微升)

高保真标记缓冲液
1个500微升(10倍)

dATP溶液
1个20微升(100毫米)

dGTP解决方案
1个20微升(100毫米)

dCTP溶液
1个20微升(100毫米)

dTTP溶液
1个20微升(100毫米)

荧光素-12-dUTP
# APP-101-FAMX-S:1个10微升(1毫米)
# APP-101-FAMX-L:5个10微升(1毫米)

DNA
1个20微升(100纳克/微升)

500 bp正向引物
1个20微升(10微米)

500 bp反向引物
1个20微升(10微米)

PCR级水
1x 1.2毫升

由用户提供
DNA模板
底漆
DNA纯化工具(可选)

1.工作溶液的制备

1.1 1mM dATP/dCTP/dGTP工作溶液的制备

• 将100 mM dATP、100 mM dCTP和100 mM dGTP溶液在冰上、voretex上解冻，并短暂旋转。
• 用PCR级水制备1:100的稀释液，以达到1 mM的最终浓度(例如2μl 100mM dATP+2μl 100mM dCTP+2μl 100mM dGTP+194μl PCR级水)。
• 1 mM ATP/CTP/GTP工作溶液可储存在-20°c下。准备等分试样以避免冷冻/解冻循环。

1.2 1mM dTTP工作溶液的制备

• 在冰上融化100 mM dTTP溶液，voretex并短暂旋转。
• 用PCR级水制备1:100的稀释液，以达到1 mM的最终浓度(例如2 μl 100 mM dTTP + 198 μl PCR级水)。
• 1 mM dTTP工作液可储存在-20°c下。准备等分试样以避免冷冻/解冻循环。

3.标准PCR标记方案

标准方案用于标记500 bp的DNA片段。反应和标记效率之间的最佳平衡通常是按照下面的标准方案用50%荧光素-12-dUTP取代来实现的，然而，个体优化可能改善个体应用的结果。

• 按照下列顺序在冰上组装PCR(无脱氧核糖核酸酶反应管)。
• Voretex和简单的降速。
• 在弱光条件下进行检测设置和反应。

推荐的骑行条件

1)退火温度取决于所用引物的熔化温度。
2)延伸时间取决于待扩增片段的长度。建议时间为2分钟/kbp。72°C时的伸长率也同样有效。

为了获得最佳扩增结果和高掺入率，对于每个新的引物-模板对，可能需要对推荐的PCR检测和循环条件进行单独优化。

4.探针纯化:

大多数杂交实验不需要探针纯化。如果下游应用需要纯化(例如通过吸光度测量进行浓度测定)，我们建议采用基于硅胶膜或凝胶过滤的纯化方法。

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