Lumafluor Green RetroBeads

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原始、可靠的荧光示踪剂

luma fluor/Green retro beads IX(100 l)luma fluor是Lumafuor公司的第一个反向示踪产品，也是一个被证明有效的产品(该产品的有效性已被数百篇从无脊椎动物到哺乳动物实验的研究论文所证实)。

该示踪剂产品在体内注射时浓度高，不易扩散，信号强，对活细胞或活体无毒，存活时间在一年以上。它与以下大多数示踪剂、原位杂交检测技术和免疫组织化学技术兼容。

Further details are presented in: Katz, L.C., Burkhalter, A., and Dreyer, W.D. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature 310: 498-500 (1984), and Katz, L.C. and Iarovici, D.M. Green fluorescent latex microspheres: a new retrograde tracer. Neuroscience 34: 511-520 (1990).

荧光乳胶微球的使用方案 

如何供应:封闭的小瓶含有悬浮在蒸馏水中的珠子的浓缩溶液。如果红色珠子用于神经元路径的逆行追踪，溶液可以原样使用，或者稀释。在大鼠视觉皮层中，当使用红色珠子时，1:4的稀释度似乎不会降低逆行标记的质量或程度。然而，对于初始实验，我们强烈建议使用全强度的溶液。除蒸馏水外，标准盐溶液(NaCl，KCl)也可用作稀释剂。所提供的绿珠*全为逆行追踪实验做好了准备。不建议稀释绿珠。

存储:珠溶液应储存在冰箱中的加湿容器中，以防止蒸发。不要冻结！被冰冻的珠子将不起作用，并且不能被解救。如果珠子变干，它们就不能被重组。这种材料没有规定保存期限，但是，如果储存得当，可以保存几年。

应用:最好使用压力注射珠子(例如，1 ml Hamilton注射器，或加压空气注射系统)。对于局部回路工作，已经通过具有30-50 μm直径吸头的玻璃移液管注入了非常小的体积(30-50 nl)。对于常规逆行追踪，使用更大体积(0.1-0.3 ul)和更大直径的移液器吸头。然而，即使注射量很大，珠子也不会从注射部位扩散很远(通常小于1 mm)。因此，为了标记投射到大结构的所有或大部分神经元，应该进行几次注射。不推荐将珠的离子电渗应用作为递送示踪剂的有效手段。然而，珠子确实有一个净负电荷。

生存时间:在大多数温血脊椎动物系统中，注射后的最短有效存活时间约为24小时。标记强度随着存活时间的延长而增加，最长可达48小时。48小时后，没有观察到标记强度的增加(或减少)。这些值在冷血动物中可能有相当大的不同，建议初始存活时间为一周。最大存活时间尚未确定，但即使在14个月的存活时间后，标签在质量或程度上也没有变化。细胞可能会被*久标记。未观察到对动物或神经元的毒性作用。

定影和处理:标准固定是用0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤，然后用0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的4%多聚甲醛洗涤。戊二醛会产生大量的组织自体荧光，这可能会模糊珠标记的神经元，如果可能，应避免使用。绿珠在戊二醛固定材料中全看不见。冷冻切片收集在磷酸盐缓冲液中，固定在明胶包被的载玻片上，风干。*全干燥后，载玻片可在二甲苯中清洗1分钟，盖上涂有Fluoromount或Krystalon的盖子。Fluoromount可从Atomergic Chemetals Corp .，Farmingdale，NY获得；Krystalon来自新泽西州吉布森镇的Harleco (EM Industries)。

短暂接触酒精和二甲苯不会造成伤害，但长时间接触(超过5分钟)会破坏珠子。珠子对甘油非常敏感，如果放在含甘油的溶液中会迅速褪色。在需要非*久性清洁/固定剂的情况下，水杨酸甲酯优于甘油。如果载玻片保存在暗处，细胞中的标记至少在一年内不会褪色(尽管背景自发荧光可能会显著增加)。迄今为止，在塑料包埋后保留珠标记的尝试尚未成功。

观察:红色珠子中的染料是罗丹明，因此可以使用任何为罗丹明设置的荧光滤光片。一些较旧的尼康罗丹明滤镜组给出了非常高的背景，这可以使标记的细胞不可见。Zeiss和Leitz标准罗丹明滤光片均获得了良好的效果。对于绿珠，宽带荧光素滤光器效果很好。黄色滤镜组给出了更强烈的信号，但代价是更高的背景。窄带荧光素滤光器将给出比宽带滤光器弱得多的信号。

即使经过长时间的观察或显微摄影，珠子也不会明显褪色。

对于低倍率、低数值孔径的干燥物镜(如X4、X10)，标签通常不可见。如果细胞被强烈标记，X10浸没物镜(数值孔径为0.4或更大)或更高功率的干物镜通常会显示细胞。然而，X25浸没物镜通常会非常清晰地显示出低倍率物镜所遗漏的标记细胞。这些警告对于绿珠来说尤其如此。在决定实验无效之前，用浸没物镜检查注射部位附近的切片。应该存在大量局部标记的细胞。

绿珠用户的附加信息:在迄今为止所做的工作中，年轻的动物似乎比年老的动物更好地传递标签。此外，年轻动物的组织自体荧光较低。因此，在涉及绿珠的实验中，如果可能的话，最好使用较年轻的动物。

因为绿珠在比红珠更短的波长下被激发，组织自体荧光是一个更大的问题。因此，将自发荧光最小化的努力将产生更好的对比信号。减少自体荧光的方法包括:1)使用更薄的切片(例如30 um而不是40或50 μm)；2)使用更年轻的动物，以及3)在盖玻片后立即检查切片(背景随着时间推移而增加)。

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