常见细胞污染分类和污染的处理

常见细胞污染

细胞污染——培养物出现浑浊、混浊。培养液pH值升高，液黄。细胞异常的形态，如胞质内细菌吞噬体。细胞的生长速率减缓，对数生长期变得不规律。异常的细胞死亡或细胞溶解情况。

真菌污染——培养液可能出现异味。培养皿内有异常的颜色、纹理或斑点。细胞显示出不正常的细胞形态，如真菌吞噬体或真菌丝状体。细胞的生长速率可能受到抑制，细胞数量不断减少。

支原体污染——支原体污染通常不会导致明显的细胞培养液变化。因此，支原体污染通常需要PCR或DNA杂交来检测。可能出现感染迹象，如出现包涵体或囊泡。细胞的生长速率减缓。

常见污染处理

因污染会改变细胞表型，在细胞种子充足及排除污染因素的情况下，首先丢弃污染细胞，重新复苏。

在未检测的情况下沿用当前细胞试剂及耗材可能导致污染扩散，应及时灭菌或丢弃。

如果怀疑细胞培养受到污染，应立即采取行动来确认并解决问题。常见的处理方法包括：

1.隔离：将受污染的培养物隔离，并最后处理污染细胞，以防止污染蔓延到其他培养物中。

2.污染源排除：查找和消除污染的来源，可使用无抗LB摇菌培养或污染检测试剂。

3.更换培养液：将受污染的培养液更换为新的培养液，细菌污染添加敏感抗生素如氨苄青霉素，真菌添加两性霉素B，支原体添加氧氟沙星以控制污染。

4.细胞重新传代：如有必要，将细胞重新传代到新的培养皿中，离心速度低于平时，200-300g。

5.污染检测：进行污染检测，以确认污染的类型和程度，从而采取适当的措施。

操作手册

● 原代细胞提取

● 血清更换注意事项及步骤

● 血清储存及化冻

● 持续更新中

原代细胞提取-1

固体组织样品（肝，肺，肿瘤等）

1.分离组织后立即移入超净台操作（＜20min)，或放入组织保存液中四度保存（不超过48h)。

注意：以下步骤均需无菌操作，且保持低温！

2.取一无菌小皿，加入3ml预冷的PBS，放入组织清洗。重复此步骤一次。

3.用无菌剪和无菌镊（高温高压灭菌）去除脂肪或坏死区域等非目标组织。

4.转移组织块至一无菌15ml/50ml离心管中，加入组织体积10倍的advanced DMEM/F12培养基（缓冲液可自行调整，与后续培养体系一致）。离心管置于冰上，用无菌剪将组织剪成肉泥状。（此步骤注意低温）

5.四度600g离心5分钟，去上清，加入消化液（浸没组织），37℃摇床（800rpm)消化15min，视解离状态调整消化时间，一般不超过45min。（消化液需视组织类型自行调整。一般组成为胶原酶1和4，浓度为400-1000U/ml，以及核酸酶5-20U/ml，可选择添加10uM ROCK抑制剂以提高组织活率。）

原代细胞提取-2

6.消化结束立即冰上，加入体积6%的血清终止消化，四度离心弃上清，用巴氏管吸取1-2ml全培养基重悬后细胞滤网过滤，根据后续目的和细胞类型选择滤网大小（类器官需要细胞团一般选择较大的100um，建库的单细胞悬液一般选择70um或更小）。

7.视上一步沉淀颜色选择是否裂红，裂红至沉淀无明显红色即可。裂红液现配，至少10ml，常温避光裂红10min。

8.用巴氏管充分混匀细胞悬液，吸取10ul细胞悬液与2x台盼蓝混匀后计数板计数。一般细胞活性＞85%为达标。如不达标，则低速(200-300g)四度离心后弃上清，重悬，再次计数和测量活性，直至达标。）

9.计算所需细胞数量并进行下一步操作，直接种板培养，点胶，或上机等。

液体样品（血液，胸水，腹水等）

1.直接600g四度离心5min后弃上清，用medium重悬清洗两次。

2.过滤可选，直接进入裂红判断步骤

3.后续步骤同上。