细胞复苏时血清更换注意事项及步骤

血清更换注意事项及步骤

一、推荐在复苏时步骤：

1.首先准备一只15ml离心管，加入3倍以上体积培养基（含10%澳范血清，1%青链霉素的适配培养基，具体培养基类型查询ATCC）。

2.将需要复苏的冻存管放于37℃水浴锅中（液面没过冻存液），并持续轻柔晃动冻存管，直至冰晶消失。

2.迅速转移细胞至无菌操作台，酒精棉球擦拭干净冻存管表面后开盖。

3.轻柔地将细胞转移至已经准备好的无菌离心管，800-1000g离心5min（不同离心机离心力不同，请选择合适离心力），弃去上清，用上述培养基重悬细胞，放入37℃，5%二氧化碳培养箱培养。并隔天更换培养基。

二、对于对数生长期的细胞，推荐按梯度更换血清：

         将上述培养基与之前所使用培养基按1：1混匀后，采用换液法更换培养基。持续培养1代后更换为只含10%澳范血清的培养基。（其余所需物质照常添加）

三、不推荐直接更换血清：

        可能导致细胞营养不良，形态变皱缩/纤细，代谢和活性相关表型改变。

血清储存及化冻

储存：在 -15°C到-20°C低温冰箱血清的保存期限为5年。

解冻：第一步：从-40°C--80°C超低温冰箱取出后需在 -20°C冰箱平衡48小时。

           第二步：立放与水平摇床并开启摇床。若解冻血清的时候无法使用摇床则在室温下融化，前半小时内每隔5分钟-10分钟轻微晃动血清使其瓶底及瓶身周边的纤粘蛋白融化。

4度冰箱解冻血清容易造成析出并丢失贴壁因子、会影响细胞的培养。

解析：血清中含有冷不溶蛋白较多如血清中纤粘蛋白（fibronection）属于冷不溶蛋白，在4度解冻时，不会溶解，是以沉淀状态在血清中。

           冰箱存在自动化霜功能，冰箱在化霜过程中箱体处于加热状态、贴近箱体底部及周边储存的试剂容易被溶解反复冻融影响质量。实验室使用化霜冰箱的时候存放试剂时需避免直接存放在锡箔纸上面。