使用贵金属纳米颗粒缀合物进行免疫印迹

由于制备贵金属纳米颗粒（例如金和银）的抗体缀合物相对容易，并且无需事先开发程序即可通过肉眼直接检测，因此这些探针在许多测定中具有很大的用途。应用包括快速测试，例如横向流动、垂直流动、蛋白质印迹和斑点印迹测定。此外，每种贵金属纳米粒子类型的光学特性 允许生成具有不同颜色的二次探针，可用于比色多重检测，图 1。

当用贵金属蛋白缀合物（例如二级金缀合物）探测印迹蛋白的膜时，在纳米颗粒探针结合后，目标蛋白的存在会以红色指示，如图 1 所示。免疫印迹和斑点印迹应用中的银到结合的金缀合物的灵敏度可与比色检测方法相媲美。此外，二级贵金属纳米颗粒蛋白缀合物很好地适应标准蛋白质印迹方案，并且对您当前的检测方案几乎不需要改变。 

与传统检测探针相比，使用贵金属纳米颗粒蛋白缀合物进行免疫印迹具有多种优势，例如： 

• 检测无需开发

• 检测不需要昂贵的成像设备

• 允许比色多重分析

以下是使用二级金缀合物检测膜上抗原的标准斑点印迹方案。相同的方案可用于金纳米海胆、银纳米颗粒和合金纳米颗粒蛋白质缀合物探针。

标准免疫金斑点印迹实验方案

1. 将 1 微升连续稀释的蛋白质（0.1 - 100 ng）滴在添加有 50 ug/ml BSA 的 PBS 中，滴在硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。

2. 让蛋白质滴干燥进入膜中。

3. 在室温下使用 1% (w/v) 奶粉的 1X PBS 将膜封闭 30 分钟。

4. 与一抗在室温下孵育 2 小时。

5. 用上述制备的封闭液清洗膜 3x5 分钟。

6. 用 0.2% 奶粉按 1:10 (OD=0.3) 稀释的二级金结合物孵育 2 小时（或更长的时间以提高灵敏度）。注意：有关金缀合物的制备，请参阅技术说明#102。

7. 如上所述洗涤 3x5 分钟。

8. 干燥膜并记录数据。

9. （可选）继续进行银增强以提高灵敏度。

图 1. 使用 Cytodiagnostics 膜银增强试剂盒增强前后 Cytodiagnostics 链霉亲和素金缀合物（左上）和我们的链霉亲和素银缀合物（右上）的斑点印迹分析示例。下图展示了使用具有不同光学特性的贵金属纳米粒子缀合物的混合物同时多重检测三种不同抗原，即抗人IgG 30nm金/银(20/80)合金缀合物（绿色）、a-小鼠IgG 30nm金/银 (80/20) 合金缀合物（红色）和 a-兔 IgG 40nm 金缀合物（紫色）。

图 2. 垂直流斑点印迹免疫分析中的多重检测。左图显示 3 个抗原（红点）和对照中的 2 个呈阳性检测。右图显示使用两种不同颜色的纳米颗粒探针（红色：金纳米颗粒，蓝色：金纳米海胆）对两种不同抗原的阳性检测。 

图 3. 使用兔抗肌动蛋白一抗对纯化肌动蛋白进行蛋白质印迹检测，然后使用 10nm 抗兔 IgG 金缀合物进行二次检测，并使用 Cytodiagnostics 膜银增强试剂盒进行增强。